Разреждане и денатуриране на библиотеки

Използвайте следните инструкции, за да подготвите библиотеки за секвениране.

В обемите е включено излишно количество реактив.

1. Разредете библиотеките до 2 nM с помощта на RSB.
2. [25B] В нова епруветка от 1,5 ml за микроцентрофуга разредете библиотеките до желаната крайна концентрация за зареждане, като използвате RSB.

Крайният обем трябва да бъде 56 μl на кладенче за проба.

Крайна зареждаща концентрация (pM)

Библиотека 2 nM (μl)

RSB (μl)

90

12,6

43,4

100

14,0

42,0

110

15,4

40,6

120

16,8

39,2

130

18,2

37,8

140

19,6

36,4

150

21,0

35,0

160

22,4

33,6

170

23,8

32,2

180

25,2

30,8
3. [10B, 1.5B] В нова епруветка от 1,5 ml за микроцентрофуга разредете библиотеките до желаната крайна концентрация за зареждане, като използвате RSB.

Крайният обем трябва да бъде 34 μl на кладенче за проба.

Крайна зареждаща концентрация (pM)

Библиотека 2 nM (μl)

RSB (μl)

90

7,7

26,3

100

8,5

25,5

110

9,4

24,6

120

10,2

23,8

130

11,1

22,9

140

11,9

22,1

150

12,8

21,2

160

13,6

20,4

170

14,5

19,5

180

15,3

18,7
4. [Незадължително] Добавете в 1–2% PhiX без денатурация, както следва.

При добавяне на PhiX, 1% е препоръчителното количество за добре балансирани библиотеки. Библиотеките с ниско разнообразие може да изискват повече. За да използвате PhiX контрола с библиотеки с ниско разнообразие, свържете се с Техническа поддръжка на Illumina за насоки.

a. Количествено определяне на PhiX.
b. Разредете 10 nM PhiX до 300 рM с помощта на RSB.
c. [25B] Добавете 1,6 μl разреден PhiX към 56 μl неденатурирана библиотека.
d. [10B, 1,5B] Добавете 1 μl разреден PhiX към 34 μl неденатурирана библиотека.
1. [25B] Добавете 14 μl 0,2 N NaOH в неденатурираната библиотечна епруветка и опционалната PhiX.
2. [10B, 1,5B] Добавете 8,5 μl 0,2 N NaOH в неденатурираната библиотечна епруветка и опционалната PhiX.
3. Затворете и след това завихрете за кратко.
4. Инкубирайте на стайна температура в продължение на 5 минути за денатуриране.
5. [25B] Добавете 210 μl Буфер за предварително зареждане, за да неутрализирате.
6. [10B, 1,5В] Добавете 127,5 μl Буфер за предварително зареждане, за да неутрализирате.
7. Затворете и след това завихрете за кратко.
8. Центрофугирайте при 280 × g в продължение на максимум 1 минута.
9. Съхранявайте библиотеките върху лед, докато бъдат прехвърлени към лентата с библиотечни епруветки (вижте Зареждане на лио вложка и лента с библиотечна епруветка).