Systemüberblick

Das MiSeq i100 Plus-System verwendet XLEAP-SBS-Chemie, die im Vergleich zu Standard-SBS-Laufzeiten hochwertige Daten mit schnellen Sequenzierungslaufzeiten erzeugt. Diese Leistungsverbesserungen werden durch einen verbesserten Nukleotidblocker/-linker und eine schnellere Polymerase mit höherer Genauigkeit für den Einbau von Nukleotiden erreicht.

Das MiSeq i100 Plus-System verwendet strukturierte Fließzellen, die die Qualität und Effizienz der Sequenzierung verbessern sollen. Strukturierte Fließzellen bestehen aus Nanowells, die komplementäre DNA-Sonden an festgelegten spezifischen Stellen auf der Oberfläche der Fließzelle enthalten. Diese Funktion macht die Kartierung von Cluster-Standorten überflüssig, beschleunigt die Sequenzierungszeit und optimiert die Nutzung des verfügbaren Platzes auf der Fließzelle.

Aufgrund der Art und Weise, wie der Prozentsatz der Cluster, die den Filter passieren (%PF), berechnet wird, zeigen Geräte mit strukturierten Fließzellen niedrigere %PF-Werte im Vergleich zu Geräten mit nicht strukturierten Fließzellen an. Trotz des niedrigeren %PF wird die Gesamtausbeute nicht beeinträchtigt.

Das MiSeq i100 Plus-System verwendet eine strukturierte Fließzelle mit Nanowells, die auf einem CMOS-Chip integriert sind. Jedes Nanowell ist mit einer Fotodiode verbunden, die Lichtemissionen am Boden des Wells erkennt und so eine schnellere Durchlaufzeiten der Sequenzierung ermöglicht.

Das MiSeq i100 Plus-System verwendet eine Zweifarbenchemie, die bei jedem Sequenzierungszyklus eine schnelle Bildgebung der Fließzelle mithilfe von blauen und grünen Kanälen ermöglicht.

Ein Merkmal des MiSeq i100 Plus-Systems ist die Anregungs-/Emissionsstrategie, die eine 2-Kanal-Anregung und eine 1-Kanal-Emission verwendet, wodurch die Durchlaufzeiten bei der Sequenzierung weiter beschleunigt werden.

A – Cluster mit Signalen in Grün und Blau.

G – Cluster ohne Signal in Grün oder Blau.

T – Cluster mit Signal nur in Grün.

C – Cluster mit Signal nur in Blau.

Das MiSeq i100 Plus-System verwendet eine indexorientierte Sequenzierung, sodass Benutzer Demultiplexing-Daten innerhalb von drei Stunden nach Beginn eines Laufs auswerten können. Die indexorientierte Sequenzierung ermöglicht bei Bedarf Anpassungen der Planung der nachfolgenden Läufe am selben Tag.

Die Verbrauchsmaterialien für das MiSeq i100 Plus-System werden bei Umgebungstemperatur versandt und gelagert, was zu einer geringeren Verpackungsmenge, einer einfachen Vorbereitung der Verbrauchsmaterialien und dem Wegfall der Notwendigkeit von Kühlgeräten führt.

Das MiSeq i100 Plus-System kann einzelsträngige und doppelsträngige Vorlagen für die Sequenzierung aufnehmen. Die Vorbereitung der Matrizenbibliothek umfasst die Verdünnung mit Puffern, die in jedem Sequenzierungskit enthalten sind und zu den Sequenzierungs-Verbrauchsmaterialien geladen werden. Die Vorlage wird im Gerät denaturiert, wodurch der Workflow vereinfacht wird.

Der Illumina Run Manager ist in die MiSeq i100 Plus Control Software integriert, die die Planung, Überprüfung und Verwaltung ausgewählter Einstellungen per Fernzugriff über einen Webbrowser ermöglicht. Siehe Illumina Run Manager.

Das MiSeq i100 Plus-System verfügt über einen Kiosk-Modus, um die Sicherheit des Systems zu erhöhen und unbefugten Benutzern den Zugriff auf das Betriebssystem zu verwehren. Wenn ein Administrator auf das Betriebssystem zugreifen muss, um eine Drittanbieteranwendung wie einen Virenscanner zu installieren, wenden Sie sich an Illumina, um einen temporären Zugangscode für den Zugriff auf das Betriebssystem zu erhalten.

Adapter/Primer-Dimere, unvollständige Bibliothekskonstrukte sowie Verunreinigungen können die Datenqualität und die Sequenzierungsausbeute beeinträchtigen. Kapillarelektrophorese-Methoden (z. B. Bioanalyzer, Fragment Analyzer oder Tape Station) können zur Qualitätskontrolle und zur Visualisierung unerwünschter Reste der Bibliothekvorbereitung verwendet werden. Zur Entfernung von Verunreinigungen kann ein zusätzlicher Reinigungsschritt durchgeführt werden.

Eine genaue Quantifizierung der Bibliothek ist für das optimale Laden der Vorlage in das System unerlässlich. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie die Empfehlungen zur Quantifizierung im Leitfaden zur Bibliothekvorbereitung befolgen. Wenn keine Anleitung bereitgestellt wird, verwenden Sie zur Gewährleistung von Konsistenz und Genauigkeit Bibliotheken zur Quantifizierung durch größennormalisierte qPCR.

Führen Sie Titrationsläufe durch, um die optimale Ladekonzentration zu ermitteln. Bei der Optimierung der Ladekonzentration sollten Sie die Titrationsexperimente auf 100 pM zentrieren und die Feinabstimmung in Schritten von 25-50 pM vornehmen.

Bibliotheken mit geringer Nukleotiddiversität können sich negativ auf die Template-Registrierung, die Datenqualität und die Ausbeute auswirken. Um die geringe Basendiversität in Bibliotheken auszugleichen, wird die Sequenzierung der PhiX Control v3 Library erhöht. Möglicherweise sind Titrationsexperimente erforderlich, um die Menge an Spike zu ermitteln, die für eine optimale Leistung erforderlich ist.