Vorbereiten und Hinzufügen von anwendungsspezifischen Primern

Anwendungsspezifische Primer werden mit HT1 verdünnt und dann in die anwendungsspezifischen Primer-Wells in der NextSeq 1000/2000-Reagenzienkartusche gegeben. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzienkartusche aufgetaut und überprüft worden ist, bevor Sie fortfahren.

Um anwendungsspezifische Bibliotheken oder Bibliotheken von Drittanbietern neben PhiX- oder Illumina-Bibliotheken vorzubereiten, versetzen Sie das jeweilige Reagenz wie folgt mit anwendungsspezifischen Read- und Index-Primern.

• XLEAP-SBS
– Anwendungsspezifische Read-Primer: VP21
– Anwendungsspezifische Index-Primer: VP14
• Standard-SBS
– Anwendungsspezifische Read-Primer: BP14
– Anwendungsspezifische Index-Primer: HP21

Bei den meisten anwendungsspezifischen Bibliothekstypen werden die Read-Primer in dem einen Well anwendungsspezifischer Primer und die Index-Primer in dem anderen Well anwendungsspezifischer Primer zusammengefasst. Aufgrund von Volumenbeschränkungen wird nicht empfohlen, einen Read-Primer mit einem Index-Primer zu kombinieren.

In den folgenden Schritten hängt das Volumen der verwendeten anwendungsspezifischen Primer von der Konzentration des Bestands an anwendungsspezifischen Primern ab.

1. Tauen Sie die zu verwendenden anwendungsspezifischen Primer auf, falls diese eingefroren sind.
2. Wenn Sie nur anwendungsspezifische Bibliotheken oder Bibliotheken von Drittanbietern verwenden, bereiten Sie anwendungsspezifische Read-Primer und/oder anwendungsspezifische Index-Primer wie folgt vor:
• Verdünnen Sie die anwendungsspezifischen Read-Primer-Mischungen mit HT1 auf ein Gesamtvolumen von 600 µl, wobei jeder anwendungsspezifische Read-Primer eine Endkonzentration von 0,3 µM aufweist.
• Verdünnen Sie die anwendungsspezifischen Index-Primer-Mischungen mit HT1 auf ein Gesamtvolumen von 600 µl, wobei jeder anwendungsspezifische Index-Primer eine Endkonzentration von 0,6 µM aufweist.
3. Wenn Sie anwendungsspezifische Bibliotheken oder Bibliotheken von Drittanbietern neben PhiX- oder Illumina-Bibliotheken verwenden, bereiten Sie anwendungsspezifische Read- oder Index-Primer wie folgt vor:
• Geben Sie jede anwendungsspezifische Read-Primer-Mischung zu 600 μl VP21 oder HP21 hinzu, um eine Endkonzentration von 0,3 μM zu erhalten.
• Geben Sie jede anwendungsspezifische Index-Primer-Mischung zu 600 μl VP14 oder BP14 hinzu, um eine Endkonzentration von 0,6 μM zu erhalten.
1. Durchstechen Sie mit einer sauberen Pipettenspitze bei Bedarf die Folienabdichtung, die die Wells „Custom 1“ (Anwendungsspezifisch 1) und „Custom 2“ (Anwendungsspezifisch 2) abdeckt.

  1. Well „Custom 1“ (Anwendungsspezifisch 1)
  2. Well „Custom 2“ (Anwendungsspezifisch 2)
2. Geben Sie 550 μl anwendungsspezifische Primer-Mischung zu Well „Custom 1“ (Anwendungsspezifisch 1) oder „Custom 2“ (Anwendungsspezifisch 2) auf der Reagenzienkartusche hinzu. Geben Sie bei Verwendung beider Wells 550 μl anwendungsspezifische Primer-Mischung in den zweiten Well hinzu.

Geben Sie die Flüssigkeit langsam ab, um Verschüttungen, Blasen und Kreuzkontamination zu vermeiden.

3. Starten Sie den Sequenzierungslauf innerhalb von 1 Stunde. Bei längerer Lagerung der Kartusche im System kann die anwendungsspezifische Primer-Mischung verdunsten.