Preparación del cartucho seco

Los consumibles de MiSeq i100 Series se envían y almacenan a temperatura ambiente. No se requiere descongelación. Antes de cargar las genotecas en el cartucho seco, diluya las genotecas y, opcionalmente, añada PhiX. Las genotecas se desnaturalizan de manera automática en el instrumento.

Realice siempre un análisis de control de calidad y optimice la concentración de carga en función de la genoteca.

Dilución de genotecas

1. Utilice tijeras para abrir el envase metálico del cartucho húmedo para obtener los tubos Resuspension Buffer (RSB) y de buffer de desnaturalización de genotecas (KLD). Deje los tubos a un lado.

Mantenga el cartucho húmedo en el envase metálico hasta que esté listo para cargarlo. El cartucho húmedo debe utilizarse en las 4 horas siguientes a la apertura del envase metálico.

2. Diluya las genotecas a una concentración de carga 10x hasta un volumen total de 30 μl utilizando un RSB.

Example: Para una concentración de carga final de 100 pM, diluya a 1 nM.

3. Agite bien en el nivel más alto durante 3 segundos y, luego, centrifugue brevemente.
4. [Opcional] Añada PhiX como se indica a continuación.
a. Para una adición de PhiX prevista ≥10 %, diluya PhiX a una concentración de carga de genotecas 10x y RSB combínelo con una solución de genoteca 10x hasta un volumen total de 30 μl. Utilice volúmenes adecuados de PhiX y genoteca para producir el porcentaje de adición de PhiX deseado.

Example: Añada 3 μl de solución 10x PhiX a 27 μl de genotecas de concentración 10x para obtener 30 μl de mezcla de genoteca 10x con un 10 % de PhiX de adición.

b. Para la adición de PhiX prevista <10 %, diluya PhiX a una concentración de carga de genoteca 6x con RSB y combine con una solución de genoteca 10x al porcentaje de adición deseado.

Example: Para una concentración de carga final de 100 pM, diluya PhiX a 0,6 nM con RSB y añada 1 μl de mezcla PhiX a 29 μl de mezcla de genoteca de concentración de carga 10x.

Los volúmenes producen una adición de PhiX de aproximadamente el 2 %. El porcentaje varía en función de la calidad y la cantidad de las genotecas.

5. En un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combine los siguientes volúmenes para diluir las genotecas a la concentración de carga final:
• Concentración de carga de genotecas de 10x (30 μl)
• KLD (270 µl)
6. Agite bien en el nivel más alto durante 3 segundos y, luego, centrifugue brevemente.
7. Guarde la mezcla en hielo hasta que esté lista para su uso.

La solución de genoteca diluida es estable durante hasta 6 horas cuando se almacena en hielo o a 4 °C.

Carga de genotecas

1. Póngase un par de guantes limpios sin polvo nuevos para evitar contaminar.
2. Use tijeras para abrir el envase metálico del cartucho seco.

Use el cartucho seco en las 4 horas siguientes a la apertura del embalaje metálico.

3. Extraiga el cartucho seco del envase.

Sujete el cartucho seco por los lados para evitar tocar la celda de flujo.

4. Deseche el envase metálico de conformidad con las normativas aplicables.
5. Con una punta de pipeta limpia, perfore el sello de aluminio que cubre el pocillo de reactivo etiquetado como Genoteca.
6. Pipetee 250 µl de solución de genoteca diluida en el pocillo Genoteca en el cartucho seco.
7. [Opcional] Pipetee el cebador personalizado en el puerto adecuado del cartucho seco. Consulte Cebadores personalizados.