Llamadas base
La llamada base determina una base (A, C, G o T) para cada clúster de un mosaico determinado en un ciclo específico. El iSeq 100 utiliza secuenciación de un tinte, que requiere un tinte y dos imágenes para codificar datos para las cuatro bases.
Las intensidades extraídas de una imagen y comparadas con una segunda imagen dan como resultado cuatro poblaciones distintas, cada una correspondiente a un nucleótido. Las llamadas base determinan a qué población pertenece cada clúster.
Visualización de las intensidades del clúster
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Base |
Tinte en la primera imagen |
Tinte en la segunda imagen |
Conclusión de imágenes comparadas |
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T |
Encendido |
Encendido |
Los clústeres que muestran intensidad en ambas imágenes son bases T. |
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A |
Encendido |
Apagado |
Los clústeres que muestran intensidad en la primera imagen únicamente son bases A. |
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C |
Apagado |
Encendido |
Los clústeres que muestran intensidad en la segunda imagen únicamente son bases C. |
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G |
Apagado |
Apagado |
Los clústeres que no muestran intensidad en ninguna imagen son bases G. |
Filtro de paso de clústeres
Durante la ejecución, RTA2 filtra los datos sin procesar para eliminar las lecturas que no cumplen con el umbral de calidad de datos. Se eliminan los clústeres superpuestos y de baja calidad.
Para la secuenciación de un tinte, RTA2 utiliza un sistema basado en la población para determinar la castidad (medición de pureza de intensidad) de una llamada base. Los clústeres pasan el filtro (PF) cuando no más de una llamada base en los primeros 25 ciclos tiene una castidad por debajo de un umbral fijo.
La alineación de PhiX se realiza en el ciclo 26 en un subconjunto de mosaicos para clústeres que pasaron el filtro. Los clústeres que no pasan el filtro no se denominan base y no están alineados.
Lecturas del índice
El proceso para las lecturas del índice de llamadas base difiere de las lecturas de secuenciación de llamadas base. Los primeros dos ciclos de una lectura de índice no pueden comenzar con dos bases G; de lo contrario, no se genera la intensidad. Para garantizar el rendimiento de desmultiplexación, la intensidad debe estar presente en cualquiera de los primeros dos ciclos.
Asegúrese de que al menos una secuencia de adaptador de índice en un grupo de bibliotecas no comience con dos bases G. Seleccione secuencias adaptadoras de índice equilibradas para que la señal esté presente en al menos una imagen (preferentemente ambas imágenes) para cada ciclo. La disposición de la placa y las secuencias proporcionadas en el kit de indexación están diseñadas para tener el equilibrio adecuado.
Para obtener más información sobre indexación y agrupación, consulte la página de soporte de la Guía de combinación de adaptadores de índice (1000000041074).
