Preparar la celda de flujo y las bibliotecas

Antes de cargar la celda de flujo y las bibliotecas en el cartucho, lleve la celda de flujo a temperatura ambiente, diluya las bibliotecas y, de manera opcional, agregue PhiX. Las bibliotecas se desnaturalizan automáticamente dentro del instrumento.

Las instrucciones de dilución se aplican a las bibliotecas de Illumina compatibles que son bicatenarias. Realice siempre un análisis de control de calidad, optimice la concentración de carga de su biblioteca y utilice un método de normalización que genere bibliotecas bicatenarias. La normalización basada en cuentas que genera bibliotecas monocatenarias no es compatible con la desnaturalización dentro del instrumento.

1. Prepare la celda de flujo de la siguiente manera.
a. Retire una nueva celda de flujo del almacenamiento a una temperatura de 2 °C a 8 °C.
b. Aparte el paquete sin abrir a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos.
2. Retire la solución amortiguadora de resuspensión (RSB) del almacenamiento de -25 °C a -15 °C. Alternativamente, use Tris-HCl de 10 mM y pH de  8,5 en lugar de RSB.
3. [Opcional] Retire el stock de PhiX de 10 nM del almacenamiento de -25 °C a -15 °C.

PhiX solo se necesita para una ejecución de adición opcional o solo PhiX.

4. Descongele el RSB y el PhiX opcional a temperatura ambiente durante 10 minutos.
5. En un microtubo de baja unión, diluya la biblioteca de 1 nM en RSB hasta el volumen correspondiente:

Tipo de biblioteca

Volumen de la biblioteca de 1 nM (μl)*

100 % PhiX (para una ejecución de solo PhiX)

12

Biblioteca AmpliSeq PLUS para Illumina

7

Preparación de ADN de Illumina

12

Preparación de ADN con enriquecimiento de Illumina

10

Nextera XT DNA

20

TruSeq DNA Nano

20

TruSeq DNA sin PCR

12

Preparación de ADN sin PCR de Illumina

15

* Los volúmenes incluyen excedentes para un pipeteo preciso.

La secuenciación exitosa depende de la dilución de bibliotecas en microtubos de baja unión.

6. Mezclar con vórtex brevemente y centrifugar a 280 × g durante 1 minuto.
7. [Opcional] Almacene la biblioteca de 1 nM a una temperatura de -25 °C a -15 °C durante un máximo de 1 mes.
1. En un microtubo de baja unión, combine los siguientes volúmenes para preparar la biblioteca de 100 μl diluida a la concentración de carga aplicable:

Tipo de biblioteca

Concentración de carga (pM)

Volumen de biblioteca de 1 nM (μl)

Volumen de RSB (μl)

100 % PhiX (para una ejecución de solo PhiX)

100

10

90

Biblioteca AmpliSeq PLUS para Illumina

50

5

95

Preparación de ADN de Illumina

100

10

90

Preparación de ADN con enriquecimiento de Illumina

75

7,5

92,5

Nextera XT DNA

150

15

85

TruSeq DNA Nano

150

15

85

TruSeq DNA sin PCR

100

10

90

Preparación de ADN sin PCR de Illumina

120

12

88

Estas tablas proporcionan ejemplos de concentraciones de carga. El iSeq 100 es compatible con todos los kits de preparación de la biblioteca Illumina, excepto SureCell WTA 3’, pero la concentración de carga óptima puede variar.

2. Mezclar con vórtex brevemente y centrifugar a 280 × g durante 1 minuto.
3. Aparte la biblioteca diluida en hielo para la secuenciación. Secuencie las bibliotecas el mismo día en que se diluyen.
4. Si no está agregando PhiX o está realizando una ejecución solo de PhiX, omita la siguiente sección y continúe con la sección Cargar insumos en el cartucho.

PhiX es una pequeña biblioteca de Illumina lista para usar con representación equilibrada de nucleótidos. Añadir una adición de PhiX del 2 % a su biblioteca proporciona métricas adicionales. Para bibliotecas de baja diversidad, utilice un aumento del 10 % para incrementar la diversidad base.

Un pico de apenas el 1 % es eficaz para proporcionar métricas adicionales, pero dificulta el pipeteo.

1. En un microtubo de baja unión, combine los siguientes volúmenes para preparar 50 μl de 1 nM de PhiX:
• PhiX de 10 nM (5 μl)
• RSB (45 μl)
2. Mezclar con vórtex brevemente y centrifugar a 280 × g durante 1 minuto.
3. [Opcional] Almacene PhiX de 1 nM a una temperatura de -25 °C a -15 °C durante un máximo de 1 mes.
4. En un microtubo de baja unión, combine 1 nM de PhiX y RSB para preparar 100 μl de PhiX diluido a la misma concentración de carga que la biblioteca.

Por ejemplo:

Concentración de carga de PhiX (pM)

Volumen de PhiX 1 nM (μl)

Volumen de RSB (μl)

25

2,5

97,5

50

5

95

70

7

93

80

8

92

100

10

90

115

11,5

88,5

200

20

80
5. Combinar PhiX y biblioteca:
• Para una adición al 2 %, agregue 2 μl de PhiX diluido a la biblioteca diluida de 100 μl.
• Para una adición al 10 %, agregue 10 μl de PhiX diluido a la biblioteca diluida de 100 μl.

El porcentaje real de PhiX varía según la calidad y cantidad de la biblioteca.

6. Mezclar con vórtex brevemente y centrifugar a 280 × g durante 1 minuto.
7. Reserve la biblioteca con la adición de PhiX en hielo.