Diluire e denaturare le librerie

Attenersi alle seguenti istruzioni per preparare le librerie per il sequenziamento.

Nei volumi è compreso il reagente in eccesso.

1. Diluire le librerie a 2 nM utilizzando RSB.
2. [25B] In una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, diluire le librerie alla concentrazione di caricamento finale desiderata utilizzando RSB.

Il volume finale deve essere di 56 μl per pozzetto del campione.

Concentrazione di caricamento finale (pM)

Libreria da 2 nM (µl)

RSB (µl)

90

12,6

43,4

100

14,0

42,0

110

15,4

40,6

120

16,8

39,2

130

18,2

37,8

140

19,6

36,4

150

21,0

35,0

160

22,4

33,6

170

23,8

32,2

180

25,2

30,8
3. [10B, 1.5B] In una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml, diluire le librerie alla concentrazione di caricamento finale desiderata utilizzando RSB.

Il volume finale deve essere di 34 μl per pozzetto del campione.

Concentrazione di caricamento finale (pM)

Libreria da 2 nM (µl)

RSB (µl)

90

7,7

26,3

100

8,5

25,5

110

9,4

24,6

120

10,2

23,8

130

11,1

22,9

140

11,9

22,1

150

12,8

21,2

160

13,6

20,4

170

14,5

19,5

180

15,3

18,7
4. [Opzionale] Aggiungere 1-2% di PhiX non denaturato nel modo seguente.

Quando si aggiunge il campione di controllo PhiX, 1% è la quantità raccomandata per ottenere librerie ben bilanciate. Le librerie a bassa diversità potrebbero richiedere una quantità maggiore. Per utilizzare un campione di controllo PhiX con librerie a bassa diversità, contattare l’Assistenza tecnica Illumina per informazioni su come procedere.

a. Quantificazione di PhiX.
b. Diluire 10 nM di PhiX a 300 pM utilizzando RSB.
c. [25B] Aggiungere 1,6 μl di PhiX diluito a 56 μl di libreria non denaturata.
d. [10B, 1.5B] Aggiungere 1 μl di PhiX diluito a 34 μl di libreria non denaturata.
1. [25B] Aggiungere 14 µl di 0,2 N NaOH nella provetta di librerie non denaturate e del campione di controllo PhiX opzionale.
2. [10B, 1.5B] Aggiungere 8,5 µl di 0,2 N NaOH nella provetta di librerie non denaturate e del campione di controllo PhiX opzionale.
3. Tappare e utilizzare brevemente un vortex.
4. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per denaturare.
5. [25B] Aggiungere 210 μl di Pre-load Buffer per neutralizzare.
6. [10B, 1,5B] Aggiungere 127,5 μl di Pre-load Buffer per neutralizzare.
7. Tappare e utilizzare brevemente un vortex.
8. Centrifugare a 280 giri per 1 minuto.
9. Conservare le librerie in ghiaccio fino al trasferimento nella striscia (a otto) provette della libreria (consultare Caricare l’inserto Lyo e la striscia (a otto) provette della libreria).