カスタムプライマーの調製と添加

カスタムプライマーは、HT1を使用して希釈してから、NextSeq 1000/2000試薬カートリッジのカスタムプライマーウェルに添加します。先に進む前に、試薬カートリッジが融解および点検済みであることを確認します。

PhiXまたはイルミナライブラリーと一緒にカスタムまたはサードパーティーライブラリーを調製するには、次のようにカスタムリードプライマーとカスタムインデックスプライマーを適切な試薬に添加します。

• XLEAP-SBS
– カスタムリードプライマー：VP21
– カスタムインデックスプライマー：VP14
• スタンダードSBS
– カスタムリードプライマー：BP14
– カスタムインデックスプライマー：HP21

ほとんどのタイプのカスタムライブラリーでは、リードプライマーをまとめて1つのカスタムプライマーウェルにプールでき、インデックスプライマーをまとめて別のカスタムプライマーウェルにプールできます。最適なベースコーリングを実施するには、カスタムリードプライマーとカスタムインデックスプライマーを組み合わせないでください。

以下の手順で使用するカスタムプライマーの量は、カスタムプライマーのストック濃度によって異なります。

1. 凍結している場合、使用する各カスタムプライマーを融解します。
2. カスタムライブラリーまたはサードパーティーライブラリーのみを使用する場合は、次のようにカスタムリードプライマーまたはカスタムインデックスプライマーを調製します。
• HT1を使用してカスタムリードプライマーミックスを希釈し、総量が600 µL、各カスタムリードプライマーの最終濃度が0.3 µMになるように調製します。
• HT1を使用してカスタムインデックスプライマーミックスを希釈し、総量が600 µL、各カスタムインデックスプライマーの最終濃度が0.6 µMになるように調製します。
3. PhiXまたはイルミナライブラリーと一緒にカスタムまたはサードパーティーライブラリーを使用する場合は、次のようにカスタムリードプライマーまたはカスタムインデックスプライマーを調製します。
• 各カスタムリードプライマーミックスを600 µLのVP21またはHP21に添加し、最終濃度0.3 µMに調製します。
• 各カスタムインデックスプライマーミックスを600 µLのVP14またはBP14に添加し、最終濃度0.6 µMに調製します。
1. 清潔なピペットチップを使用して、カスタム1ウェルまたはカスタム2ウェルを覆っているホイルシールに必要に応じて穴を開けます。

  1. カスタム1ウェル
  2. カスタム2ウェル
2. 550 µLのカスタムプライマーミックスを試薬カートリッジのカスタム1ウェルまたはカスタム2ウェルに添加します。両方のウェルを使用する場合は、550 µLのカスタムプライマーミックスを2番目のウェルに添加します。

こぼれ、気泡、クロスコンタミネーションを避けるために、液体をゆっくりと分注します。

3. 1時間以内にシーケンスランを開始します。カートリッジをシステム内に保管すると、カスタムプライマーミックスが蒸発する原因になります。