フローセルとライブラリーの準備

フローセルとライブラリーをカートリッジにロードする前に、フローセルを室温に戻し、ライブラリーを希釈して、必要に応じてPhiXを添加します。ライブラリーは装置内で自動的に変性されます。

以下の希釈方法が、装置でサポートされている二本鎖イルミナライブラリーに適用されます。常にライブラリーのQCを行い、使用するライブラリーのローディング濃度を最適化し、二本鎖ライブラリーを生成するノーマライゼーション法を採用してください。一本鎖ライブラリーを生成するBead-based normalization法は装置上での変性に対応していません。

ライブラリーを1 nMに希釈

フローセルを次のように準備します。

2℃～8℃の保管庫から新しいフローセルを取り出します。

未開封のパッケージを室温で10～15分間放置します。

-25℃～-15℃の保管庫からResuspension Buffer（RSB）を取り出します。または、RSBの代わりに10 mM Tris-HCl, pH 8.5を使用します。

（オプション）-25℃～-15℃の保管庫から10 nM PhiXストックを取り出します。

PhiXが必要となるのは、オプションで添加する場合またはPhiXのみのランを実行する場合のみです。

RSBとオプションのPhiXを室温で10分間融解します。

低吸着マイクロ遠心チューブにRSBを加えてライブラリーを希釈し、以下の量の1 nMライブラリーを調製します。

ライブラリータイプ	1 nMライブラリー量（µL）*
100% PhiX（PhiXのみのランの場合）	12
AmpliSeq Library PLUS for Illumina	7
Illumina DNA Prep	12
Illumina DNA Prep with Enrichment	10
Nextera XT DNA	20
TruSeq DNA Nano	20
TruSeq DNA PCR-Free	12
Illumina DNA PCR-Free Prep	15

* これらの分量には、正確なピペッティングのための余分が含まれています。

シーケンスを正常に行うため、ライブラリーを低吸着マイクロ遠心チューブで希釈する必要があります。

軽くボルテックスして、280 × gで1分間遠心します。

（オプション）1 nMのライブラリーは-25℃～-15℃で最長1か月保管できます。

1 nMライブラリーをローディング濃度に希釈

低吸着マイクロ遠心チューブで、次の量を混ぜ合わせて該当するローディング濃度に希釈した100 µLのライブラリーを調製します。

ライブラリータイプ	ローディング濃度（pM）	1 nMライブラリー量（µL）	RSB量（µL）
100% PhiX（PhiXのみのランの場合）	100	10	90
AmpliSeq Library PLUS for Illumina	50	5	95
Illumina DNA Prep	100	10	90
Illumina DNA Prep with Enrichment	75	7.5	92.5
Nextera XT DNA	150	15	85
TruSeq DNA Nano	150	15	85
TruSeq DNA PCR-Free	100	10	90
Illumina DNA PCR-Free Prep	120	12	88

上記の表はローディング濃度の一例です。iSeq 100はSureCell WTA 3'以外のイルミナの全ライブラリー調製キットに適合していますが、最適なローディング濃度は一定ではありません。

軽くボルテックスして、280 × gで1分間遠心します。

希釈したライブラリーはシーケンス開始まで氷上に置いてください。希釈した当日のうちにシーケンスを開始してください。

PhiXを添加しない場合、またはPhiXのみのランを行う場合は、次のセクションを飛ばして、「消耗品のカートリッジへのロード」に進んでください。

PhiXコントロールの添加（オプション）

PhiXは、塩基存在比のバランスが取れた、ゲノムサイズの小さな調製済みのイルミナのライブラリーです。2%のPhiXをライブラリーに添加することで、追加のメトリクスが得られます。多様性の低いライブラリーについては、塩基の多様性を増加させるために10%の添加を用いることが推奨されます。

追加のメトリクスを得るという目的では1%程度の低い割合の添加でも効果的ですが、その場合はピペット操作が困難になります。

低吸着マイクロ遠心チューブに次の量を加えて50 µLの1 nM PhiXを調製します。

•

10 nM PhiX（5 µL）

•

RSB（45 µL）

軽くボルテックスして、280 × gで1分間遠心します。

（オプション）1 nMのPhiXは-25℃～-15℃で最長1か月保管できます。

低吸着マイクロ遠心チューブに1 nMのPhiXとRSBを加えて、ライブラリーと同じローディング濃度に希釈した100 µLのPhiXを調製します。

例：

PhiXローディング濃度（pM）	1 nM PhiX量（µL）	RSB量（µL）
25	2.5	97.5
50	5	95
70	7	93
80	8	92
100	10	90
115	11.5	88.5
200	20	80

PhiXとライブラリーの混合：

•

2%添加を行うには、2 µLの希釈したPhiXを100 µLの希釈したライブラリーに添加します。

•

10%添加を行うには、10 µLの希釈したPhiXを100 µLの希釈したライブラリーに添加します。

実際のPhiXの割合はライブラリーのクオリティと量により異なります。

軽くボルテックスして、280 × gで1分間遠心します。

PhiXを添加したライブラリーを氷上に置いておきます。