シーケンスの出力

このセクションでは、Real-Time AnalysisとReal-Time Analysisワークフローについて詳しく説明します。

Real-Time Analysisの概要

Real-Time Analysisソフトウェアは装置の制御コンピューターで実行されます。シーケンスランの間、このソフトウェアはイメージから蛍光強度を抽出してベースコーリングを行い、ベースコールに対するクオリティスコアを評価します。

iSeq 100システムはRTA2（Real-Time Analysisの実装版）を使用します。RTA2とコントロールソフトウェアがウェブHTTPインターフェースを通じて通信し、メモリーファイルを共有します。RTA2が終了した場合、処理は再開されず、ランデータは保存されません。

デマルチプレックスの計算は実行されないので、Sequencing Analysis Viewerでは［Index］タブは表示されません。

RTA2には次の入力ファイルが必要です。

• ローカルシステムメモリーに含まれるタイルイメージ。
• XML形式でのReal-Time Analysis設定ファイル。
• RunInfo.xml。このファイルはランの開始時に自動的に生成されます。

RTA2はコントロールソフトウェアから、RunInfo.xmlの場所や、出力フォルダーが指定されているかどうかなどの情報を含むコマンドを受け取ります。ラン名、サイクル数、リードにインデックスを付けるかどうか、およびフローセル上のタイル数は、RunInfo.xmlを介して渡されます。

RTA2はログファイルを生成し、それらをRTALogsフォルダーに書き込みます。エラーは、TSVファイル形式でエラーファイルに記録されます。

処理の終了時に、以下のログファイルとエラーファイルが最終出力先に転送されます。

• *GlobalLog*.tsv。重要なランイベントの要約が含まれます。
• *Error*.tsv。ラン中に発生したエラーのリストが含まれます。
• *WarningLog*.tsv。ラン中に発生した警告のリストが含まれます。

蛍光強度の抽出

各クラスターの蛍光強度値を決定します。

 

フェージングの補正

フェージングとプレフェージングの効果を補正します。

 

ベースコーリング

すべてのクラスターのベースコールを決定します。

 

クオリティスコアリング

すべてのベースコールにクオリティスコアを割り当てます。

蛍光強度の抽出では、特定のイメージの各ナノウェルの強度値が計算されます。

シーケンス反応中、クラスター内の各DNA鎖はサイクルごとに1塩基ずつ伸長します。現在のインコーポレーションサイクルとDNA鎖の位相がずれると、フェージングとプレフェージングが起こります。

• 1塩基分、反応が遅れる方へずれるとフェージングが起こります。
• 1塩基分、反応が先へ進む方へずれるとプレフェージングが起こります。

フェージングとプレフェージング

  1. 塩基がフェージングしているリード
  2. 塩基がプレフェージングしているリード

フェージングとプレフェージングの効果はRTA2によって補正されます。これにより、ラン実行中のすべてのサイクルで最大限のデータ品質が得られます。

クオリティスコア、またはQスコアは、不正確なベースコールの確率の予測値です。高いQスコアは、ベースコールのクオリティが高く、従ってそれが正しい可能性が高いことを示しています。

Qスコアは、小さな誤り確率をコンパクトに表現する方法です。Q(X)はクオリティスコアを示しており、Xはそのスコアです。以下の表に、クオリティスコアとエラーの起こり易さの関連性を示します。

Qスコア Q(X)

エラーの起こり易さ

Q40

0.0001（10,000分の1）

Q30

0.001（1,000分の1）

Q20

0.01（100分の1）

Q10

0.1（10分の1）

クオリティスコアリングはPhredアルゴリズムの修正版に基づきます。

クオリティスコアリングは、各ベースコールについて、いくつかの予測モデルのセットを計算し、その値をQuality tableから探索しQスコアとして割り当てます。Quality tableは、当該のシーケンシングシステム構成とケミストリーバージョンの組み合わせから得られるランに対して、最適なクオリティの予測値を与えるために作られています。

Qスコアの決定後、結果がベースコールファイルに記録されます。