Iniciar corrida do sequenciamento XLEAP-SBS

Esta etapa inicia uma corrida do sequenciamento XLEAP-SBS em um dos quatro modos:

• Modo Cloud (Nuvem)—Seleciona-se a corrida de uma lista de corridas planejadas no NextSeq 1000/2000 Control Software. Durante o sequenciamento, os dados CBCL são carregados no BaseSpace Sequence Hub. Após o sequenciamento, o DRAGEN no BaseSpace Sequence Hub é iniciado automaticamente.
• Modo Hybrid (Híbrido)—Seleciona-se a corrida de uma lista de corridas planejadas no NextSeq 1000/2000 Control Software. Após o sequenciamento, a análise do instrumento começa automaticamente. Os dados CBCL e os arquivos de saída da análise secundária DRAGEN são armazenados na pasta de saída selecionada.
• Modo Local—Uma planilha de amostras em formato de arquivo v2 é importada manualmente para o NextSeq 1000/2000 Control Software. Após o sequenciamento, a análise do instrumento começa automaticamente. Os dados CBCL e os arquivos de saída da análise secundária DRAGEN são armazenados na pasta de saída selecionada. Se a opção Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) estiver selecionada, a análise poderá ser iniciada pelos aplicativos do BaseSpace Sequence Hub após a conclusão do sequenciamento.
• Modo Standalone (Autônomo)—Configure uma corrida, seguindo as instruções do NextSeq 1000/2000 Control Software para gerar dados CBCL.

Se o visor for aberto durante a verificação pré-corrida ou durante a corrida, poderá haver falha na corrida.

Durante a abertura e o fechamento do visor, mantenha as mãos afastadas do instrumento para evitar ferimentos.

1. Configure o modo de corrida conforme descrito em Configurar modo de corrida.
2. Selecione Start (Iniciar).
3. Digite suas credenciais de acesso no BaseSpace Sequence Hub e selecione Sign In (Acessar).
4. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento), selecione o Workgroup (Grupo de trabalho) que contenha sua corrida criada em Run Planning (Planejamento de corrida) no BaseSpace Sequence Hub.

É necessário selecionar um grupo de trabalho para prevenir erros. Antes de continuar, verifique se selecionou um grupo de trabalho.

5. Selecione Next (Avançar).
6. Selecione sua corrida.
7. Confirme que a versão de Analysis (Análise), Run Length (Comprimento de corrida) e Secondary Analysis (Análise secundária) correspondem à corrida correta.

A análise exibe Cloud_ para indicar que aquela análise ocorre no BaseSpace Sequence Hub.

8. Selecione Review (Revisão).
9. [Opcional] Digite o local do primer da leitura personalizada e o primer de índice personalizado.

Para obter informações sobre como preparar e adicionar primers personalizados, consulte Primers personalizados. Acesse a página Compatible Products (Produtos compatíveis) de seu kit de preparação de biblioteca para verificar se primers personalizados Illumina são necessários.

10. [Opcional] Selecione uma receita personalizada. Para mais informações, consulte Sequenciamento do ciclo escuro.

Caso esteja usando o kit Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus ou o kit Illumina Stranded mRNA Prep, a receita personalizada é selecionada automaticamente.

11. [Opcional] Para desnaturar e diluir bibliotecas manualmente, desmarque a caixa de seleção Denature and Dilute On Board (Desnaturar e diluir dentro do aparelho). Consulte Desnaturação e diluição manuais do XLEAP-SBS.

A seleção padrão será definida nas configurações do NextSeq 1000/2000 Control Software.

12. [Opcional] Para alterar a pasta de saída, selecione o campo Output Folder (Pasta de saída) e digite um novo local.

O campo Output Folder (Pasta de saída) é preenchido automaticamente com suas configurações padrão e é obrigatório, a menos que a opção Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) esteja selecionada.

Caso você tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corrida e armazenamento), Save to BaseSpace Sequence Hub (Salvar no BaseSpace Sequence Hub) exibirá Enabled (Habilitado).

Caso você tenha selecionado Proactive and Run Monitoring (Proactive e monitoramento de corrida), Save to BaseSpace Sequence Hub (Salvar no BaseSpace Sequence Hub) exibirá Disabled (Desabilitado).

13. Revise as informações de corrida e selecione Prep (Preparação).
1. Configure o modo de corrida conforme descrito em Configurar modo de corrida.
2. Selecione Start (Iniciar).
3. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) ou Proactive and Run Monitoring (Proativo e monitoramento de corridas), digite suas credenciais de acesso no BaseSpace Sequence Hub e selecione Sign In (Acessar).
4. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento), selecione o BaseSpace Sequence Hub Workgroup onde deseja salvar sua corrida e selecione Next (Avançar).

É necessário selecionar um grupo de trabalho para prevenir erros. Antes de continuar, verifique se selecionou um grupo de trabalho.

5. Selecione Choose... (Escolher…) em Start With Sample Sheet (Iniciar com planilha de amostras) e navegue até a planilha de amostras v2 no instrumento, unidade portátil ou unidade de rede montada do NextSeq 1000/2000. Os nomes de arquivo da planilha de amostras não podem conter caracteres especiais.

O NextSeq 1000/2000 Control Software v1.3 ou posterior detecta automaticamente a versão do DRAGEN na planilha de amostras e, se necessário, solicita que você altere as versões. A versão do DRAGEN deve estar instalada no sistema. Para informações sobre instalação, consulte Atualizações de software.

• Run Planning Used (Planejamento de corrida utilizado) – Selecione a pasta .zip que contém a planilha de amostras v2 e os arquivos de apoio, se aplicável. De outro modo, selecione a planilha de amostras v2.
• Run Planning Not Used (Planejamento de corrida não utilizado) – Verifique se o arquivo de apoio da análise secundária está no mesmo diretório que a planilha de amostras v2.

A planilha de amostras selecionada deverá estar em formato v2. Para criar uma planilha de amostras v2, baixe a planilha de amostras gerada por Run Planning (Planejamento de corrida) no BaseSpace Sequence Hub ou edite um modelo de planilha de amostras v2 fornecido na página de suporte do NextSeq 1000/2000. Para obter mais informações sobre formato e requisitos da planilha de amostra v2, consulte Recurso da planilha de amostras v2. Verifique se os arquivos mencionados na planilha de amostras estão na mesma pasta que a planilha de amostras.

6. Selecione Review (Revisão).
7. [Opcional] Digite o local do primer da leitura personalizada e o primer de índice personalizado.

Para obter informações sobre como preparar e adicionar primers personalizados, consulte Primers personalizados. Acesse a página Compatible Products (Produtos compatíveis) de seu kit de preparação de biblioteca para verificar se primers personalizados Illumina são necessários.

8. [Opcional] Selecione uma receita personalizada. Para mais informações, consulte Sequenciamento do ciclo escuro.

Caso esteja usando o kit Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero Plus ou o kit Illumina Stranded mRNA Prep, a receita personalizada é selecionada automaticamente.

9. [Opcional] Para desnaturar e diluir bibliotecas manualmente, desmarque a caixa de seleção Denature and Dilute On Board (Desnaturar e diluir dentro do aparelho). Consulte Desnaturação e diluição manuais do XLEAP-SBS.

A seleção padrão será definida nas configurações do NextSeq 1000/2000 Control Software.

10. [Opcional] Para alterar a pasta de saída, selecione o campo Output Folder (Pasta de saída) e digite um novo local.

O campo Output Folder (Pasta de saída) é preenchido automaticamente com suas configurações padrão e é obrigatório, a menos que a opção Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) esteja selecionada.

Caso você tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corrida e armazenamento), Save to BaseSpace Sequence Hub (Salvar no BaseSpace Sequence Hub) exibirá Enabled (Habilitado).

Caso você tenha selecionado Proactive and Run Monitoring (Proactive e monitoramento de corrida), Save to BaseSpace Sequence Hub (Salvar no BaseSpace Sequence Hub) exibirá Disabled (Desabilitado).

11. Revise as informações de corrida e selecione Prep (Preparação).
1. Configure o modo de corrida conforme descrito em Configurar modo de corrida.
2. Selecione Start (Iniciar).
3. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) ou Proactive and Run Monitoring (Proativo e monitoramento de corridas), digite suas credenciais de acesso no BaseSpace Sequence Hub e selecione Sign In (Acessar).
4. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento), selecione o BaseSpace Sequence Hub Workgroup onde deseja salvar sua corrida e selecione Next (Avançar).
5. Selecione Set Up New Run (Configurar nova corrida).
6. No campo Run Name (Nome da corrida), digite um nome exclusivo de sua preferência para identificar a corrida atual.

O nome da corrida pode conter caracteres alfanuméricos, traços, hifens e sublinhados.

7. Para Read Type (Tipo de leitura), selecione quantas leituras de sequenciamento serão efetuadas:
• Single Read (Leitura única)—Efetua uma só leitura, que é a opção mais simples e rápida.
• Paired End—Efetua duas leituras, que geram dados com qualidade mais alta e fornecem um alinhamento mais preciso.
8. Insira o número de ciclos efetuados em cada leitura:

Não existe um número máximo de ciclos de índice, mas a soma dos ciclos de leitura com os ciclos de índice deve ser menor do que o número de ciclos indicado no rótulo do cartucho mais 38. Consulte Número compatível de ciclos.

• Read 1 (Leitura 1)—Digite de 26 a 301 ciclos.
• Index 1 (Índice 1)—Insira o número de ciclos para o primer de Índice 1 (i7). Para uma corrida somente de PhiX, digite 0 em ambos os campos de índice.
• Index 2 (Índice 2)—Insira o número de ciclos para o primer de Índice 2 (i5).
• Read 2 (Leitura 2)—Insira até 301 ciclos. Este valor é normalmente igual ao valor da Leitura 1.
9. Caso tenha selecionado Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corrida e armazenamento), selecione Choose... (Escolher...) para importar uma planilha de amostras.

O NextSeq 1000/2000 Control Software v1.3 ou posterior detecta automaticamente a versão do DRAGEN na planilha de amostras e, se necessário, solicita que você altere as versões. A versão do DRAGEN deve estar instalada no sistema. Para informações sobre instalação, consulte Atualizações de software.

A planilha de amostras selecionada deverá estar em formato v2. Para criar uma planilha de amostras v2, baixe a planilha de amostras gerada por Run Planning (Planejamento de corrida) no BaseSpace Sequence Hub ou edite um modelo de planilha de amostras v2 fornecido na página de suporte do NextSeq 1000/2000. Para obter mais informações sobre formato e requisitos da planilha de amostra v2, consulte Recurso da planilha de amostras v2. Verifique se os arquivos mencionados na planilha de amostras estão na mesma pasta que a planilha de amostras.

10. [Opcional] Digite o local do primer da leitura personalizada e o primer de índice personalizado.

Para obter informações sobre como preparar e adicionar primers personalizados, consulte Primers personalizados. Acesse a página Compatible Products (Produtos compatíveis) de seu kit de preparação de biblioteca para verificar se primers personalizados Illumina são necessários.

11. [Opcional] Selecione uma receita personalizada. Para mais informações, consulte Sequenciamento do ciclo escuro.
12. [Opcional] Para desnaturar e diluir bibliotecas manualmente, desmarque a caixa de seleção Denature and Dilute On Board (Desnaturar e diluir dentro do aparelho). Consulte Desnaturação e diluição manuais do SBS padrão.

A seleção padrão será definida nas configurações do NextSeq 1000/2000 Control Software.

13. [Opcional] Para alterar a pasta de saída, selecione o campo Output Folder (Pasta de saída) e digite um novo local.

O campo Output Folder (Pasta de saída) é preenchido automaticamente com suas configurações padrão e é obrigatório, a menos que a opção Proactive, Run Monitoring and Storage (Proativo, monitoramento de corridas e armazenamento) esteja selecionada.

14. Selecione Prep (Preparação).
1. Verifique se o cartucho foi previamente descongelado e preparado de acordo com Preparar o cartucho antes de carregar a lâmina de fluxo (aba cinza removida) e a biblioteca diluída.
2. Selecione Load (Carregar).

O NextSeq 1000/2000 Control Software abre o visor e ejeta a bandeja.

3. Coloque o cartucho na bandeja com o rótulo virado para cima e a lâmina de fluxo dentro do instrumento. Empurre o cartucho até ele travar no lugar.

4. Selecione Close (Fechar) para retrair o cartucho e fechar o visor.

O NextSeq 1000/2000 Control Software exibe informações dos materiais de consumo escaneados após cerca de três minutos.

5. [Opcional] Selecione Eject Cartridge (Ejetar cartucho) para remover o cartucho.

O visor abrirá após 1 minuto e ejetará o cartucho.

6. Selecione Sequence (Sequência).

As verificações pré-corrida abrangem uma verificação do instrumento seguida de uma verificação de fluidos. A verificação de fluidos perfura as vedações do cartucho, fazendo o instrumento emitir 3 ou 4 sons de estalo. Este som é esperado. O reagente passou então pela lâmina de fluxo.

Depois que a verificação de fluidos se inicia, os materiais de consumo não podem ser reutilizados.

1. Aguarde cerca de 15 minutos até que as verificações pré-corrida sejam concluídas.

A corrida é iniciada automaticamente após uma conclusão bem-sucedida.

2. Se ocorrer um erro durante a verificação do instrumento, selecione Retry (Tentar novamente) para refazer a verificação.

Quando uma verificação estiver em andamento, o respectivo círculo será exibido em movimento.

3. Para resolver erros recorrentes, consulte Resolução de mensagens de erro.
1. Monitore o progresso e as métricas das corrida quando forem exibidos na tela Sequencing (Sequenciamento).
• Estimated run completion (Conclusão prevista da corrida)—Data e hora aproximadas da conclusão da corrida. A métrica da conclusão prevista da corrida requer 10 execuções anteriores para calcular precisamente o tempo de conclusão.
• Average %Q30 (Média %Q30)—A média percentual de identificação de bases com um Q-score ≥30.
• Projected Yield (Rendimento projetado)—O número esperado de bases identificadas para a corrida.
• Total Reads PF (Total de leituras do filtro de passagem)—A quantidade de passagens de clusters pelo filtro tipo paired-end (se aplicável), em milhões.
• Real Time Demux (Demultiplexação em tempo real)—Status da demultiplexação quando iniciada no começo da Read 2 (Leitura 2) após a conclusão dos ciclos Read 1 (Leitura 1), Index 1 (Índice 1) e Index 2 (Índice 2). O status exibirá Complete (Concluído), mesmo que os ciclos de índice não tenham sido realizados. Não disponível para corrida no modo Nuvem.
• Real Time Alignment (Alinhamento em tempo real)—Status do alinhamento da Read 1 (Leitura 1) quando iniciado no começo da Read 2 (Leitura 2) após a conclusão dos ciclos Read 1 (Leitura 1), Index 1 (Índice 1) e Index 2 (Índice 2). Não disponível para corrida no modo Nuvem.

As medidas de Q30 e rendimento são exibidos depois do ciclo 26.

2. Para monitorar os processos da corrida, selecione o menu do software de controle e depois Process Management (Gerenciamento de processos).
3. Para cancelar uma corrida, selecione End Run (Encerrar corrida). Para mais informações sobre cancelamento de corridas, consulte Cancelar uma corrida.
4. Descarregue os materiais de consumo do instrumento. Remova o cartucho do instrumento em até 3 dias.