Arbetsflöde för Real-Time Analysis

Registrering

Registrerar platsen för varje kluster i den mönstrade flödescellen.

 

Intensitetsextraktion

Fastställer ett intensitetsvärde för varje kluster.

 

Fasningskorrigering

Korrigerar effekten av fasning och förfasning.

 

Basbestämning

Fastställer en basbestämning för varje kluster.

 

Kvalitetsresultat

Tilldelar ett kvalitetsresultat till varje basbestämning.

Ett kvalitetsresultat, eller Q-resultat, mäter sannolikheten för en felaktig basbestämning. Högt Q-resultat indikerar att en basbestämning är av bra kvalitet och sannolikt är korrekt. När Q-resultatet är bestämt sparas resultaten i basbestämningsfiler (*.cbcl).

Q-resultat är ett praktiskt sätt att mäta sannolikheten för små fel. Kvalitetspoäng representeras som Q(X), där X är poängen. I nedanstående tabell visas relationen mellan ett kvalitetsresultat och sannolikheten för fel.

Q-resultat Q(X)

Felsannolikhet

Q40

0,0001 (1 på 10 000)

Q30

0,001 (1 på 1 000)

Q20

0,01 (1 på 100)

Q10

0,1 (1 på 10)

Metoden beräknar en uppsättning variabler för varje basbestämning och använder sedan variablernas värden för att hitta Q-resultatet i en kvalitetstabell. Kvalitetstabeller skapas för att ge optimalt kalibrerade kvalitetsprognoser för körningar som skapas av en specifik konfiguration av sekvenseringsplattform och uppsättning av kemikalier.

Kvalitetsresultat baseras på en anpassad version av Phred-algoritmen.

För att generera Q-tabellen för sekvenseringssystemet NextSeq 1000/2000 fastställdes tre grupper av basbestämningar baserat på kluster av dessa specifika, förutsägbara funktioner. Efter gruppering av basbestämningarna beräknades den genomsnittliga felfrekvensen empiriskt för var och en av de tre grupperna och motsvarande Q-resultat registrerades i Q-tabellen tillsammans med de prediktiva funktionerna som korrelerar till den gruppen. Som sådan är endast tre Q-resultat möjliga med RTA och dessa Q-resultat representerar den genomsnittliga felfrekvensen för gruppen. Sammantaget leder denna process till förenklade, men ändå mycket noggranna, kvalitetsresultat. RFID på kassetten bestämmer vilken version av RTA som används.

 

Q-tabell

Basbestämningsgrupper

Specifika tilldelade poäng

RTA-version som används

XLEAP-SBS-kassetter (50, 100, 200, 300 och 600 cykler)

Marginal (≤Q17), medium (Q18-29) och högkvalitativ (≥Q30)

12, 24 respektive 40

RTA4

Standard SBS-kassetter (50, 100, 200 och 300 cykler)

Marginal (≤Q17), medium (Q18-29) och högkvalitativ (≥Q30)

12, 26 respektive 34

RTA3

Standard SBS-kassetter (600 cykler)

Marginal (≤Q17), medium (Q18-29) och högkvalitativ (≥Q30)

9, 20 respektive 34

RTA3

Dessutom tilldelas alla ogiltiga resultat 0 (icke-bestämningar). Den här rapporteringsmodellen för Q-resultat minskar kraven på lagringsutrymme och bandbredd utan att påverka noggrannhet eller prestanda.