Secuenciación

La generación, secuenciación y análisis de clústeres comprenden la secuenciación en el sistema iSeq 100. Durante una ejecución de secuenciación, cada paso se lleva a cabo automáticamente. Según la configuración del sistema, se realiza un análisis adicional fuera del instrumento después de que se completa la ejecución.

• Generación de clústeres: la biblioteca se desnaturaliza automáticamente en hebras individuales y se diluye aún más dentro del instrumento. Durante la generación de clústeres, las moléculas de ADN únicas se unen a la superficie de la célula de flujo y se amplifican para formar clústeres.
• Secuenciación: se obtienen imágenes de los clústeres utilizando química de un solo tinte, que utiliza una etiqueta fluorescente y dos ciclos de imágenes para codificar los datos de los cuatro nucleótidos. El primer ciclo de imágenes detecta adenina (A) y timina (T). Luego, un ciclo de química escinde el tinte de A y agrega simultáneamente un tinte similar a la citosina (C). El segundo ciclo de imágenes detecta C y T. Después del segundo ciclo de imágenes, el software Real-Time Analysis realiza llamadas base, filtrado y puntuación de calidad. Este proceso se repite para cada ciclo de secuenciación. Para obtener más información sobre la química de un tinte, consulte la sección Llamadas base.
• Análisis: a medida que avanza la ejecución, el software de control transfiere automáticamente archivos de llamadas base (*.bcl) a la carpeta de salida especificada para el análisis de datos. El método de análisis de datos depende de la aplicación y la configuración del sistema.

El volumen de carga es de 20 μl. La concentración de carga varía según el tipo de biblioteca y el cartucho.

Tipo de biblioteca

Concentración de carga (pM)

Volumen de biblioteca de 1 nM (μl)

Volumen de RSB (μl)

100 % PhiX (para una ejecución de solo PhiX)

100

10

90

Biblioteca AmpliSeq PLUS para Illumina

50

5

95

Preparación de ADN de Illumina

100

10

90

Preparación de ADN con enriquecimiento de Illumina

75

7,5

92,5

Nextera XT DNA

150

15

85

TruSeq DNA Nano

150

15

85

TruSeq DNA sin PCR

100

10

90

Preparación de ADN sin PCR de Illumina

120

12

88

Para otros tipos de biblioteca, Illumina recomienda 50 pM como concentración de carga inicial. Optimice esta concentración en ejecuciones posteriores para identificar una concentración de carga que arroje de manera consistente datos que cumplan con las especificaciones.

Las concentraciones de carga que son demasiado altas o demasiado bajas dan como resultado una generación de clústeres y métricas de ejecución subóptimas. Para obtener más información, consulte la Guía general de optimización de clústeres (documento n.° 1000000071511).

Para cada lectura, introduzca al menos 26 ciclos y como máximo 151 ciclos a fin de optimizar la calidad de los datos. La cantidad exacta de ciclos depende de su experimento.

Los números de ciclo mínimo y máximo incluyen un ciclo adicional. Siempre agregue un ciclo a la longitud de lectura deseada para corregir los efectos de fase y prefase. La longitud de lectura es el número de ciclos de secuenciación en la Read 1 (Lectura 1) y la Read 2 (Lectura 2), que excluye los ciclos adicionales y los ciclos de índice.

Ejemplos de configuraciones de ejecución:

• Para una longitud de lectura de 36 (lectura única), introduzca 37 en el campo Read 1 (Lectura 1).
• Para una longitud de lectura de 150 por lectura (extremo emparejado), introduzca 151 en el campo Read 1 (Lectura 1) y 151 en el campo Read 2 (Lectura 2).
• Cuando manipule reactivos y otros productos químicos, use gafas de seguridad, una bata de laboratorio y guantes sin polvo. Cámbiese los guantes cuando se le indique para evitar la contaminación cruzada.
• Asegúrese de tener los insumos y equipos necesarios antes de comenzar un protocolo. Consulte la sección Insumos y equipos.
• Siga los protocolos en el orden que se muestra, utilizando los volúmenes, temperaturas y duraciones especificados.
• A menos que se especifique un punto de parada, pase inmediatamente al siguiente paso.
• Si planea descongelar el cartucho en un baño de agua, almacene el cartucho entre -25 °C y -15 °C durante al menos 1 día antes de descongelarlo. Un baño de agua es el más rápido de los tres métodos de descongelación.
1. Póngase un nuevo par de guantes sin polvo.
2. Retire el cartucho del almacenamiento de -25 °C a -15 °C.
3. Si el cartucho está en caja, retírelo de la caja, pero no abra la bolsa de aluminio blanca.

4. Descongele el cartucho embolsado utilizando uno de los siguientes métodos. Úselo inmediatamente después de descongelar, sin volver a congelar ni almacenar de otro modo.

Método

Tiempo de descongelación

Instrucción

Baño de agua de 20 °C a 25 °C

6 horas, sin superar las 18 horas
• Use 6 l (1,5 gal) de agua por cartucho.
• Configure un baño de agua con temperatura controlada a 25 °C o mezcle agua caliente y fría para alcanzar entre 20 °C y 25 °C.
• Coloque la etiqueta de la bolsa hacia arriba, sumerja el cartucho por completo y aplique un peso de ~2 kg (4,5 lb) para evitar que flote.
• No apile cartuchos en el baño de agua a menos que la temperatura esté controlada.

Refrigerador de 2 °C a 8 °C

36 horas, sin superar las 72 horas

Coloque el cartucho de manera que la etiqueta mire hacia arriba y el aire pueda circular por todos los lados, incluida la parte inferior.

Aire a temperatura ambiente

9 horas, sin superar las 18 horas

Coloque el cartucho de manera que la etiqueta mire hacia arriba y el aire pueda circular por todos los lados, incluida la parte inferior.

Descongelar el cartucho en un baño de agua directamente del envío, cuando se ha almacenado en hielo seco, puede afectar negativamente el rendimiento. Almacénelo a una temperatura de -25 °C a -15 °C durante al menos 1 día antes de descongelar.

5. Si está mojado por un baño de agua, séquelo con toallas de papel.