XLEAP-SBSシーケンスランの開始

このステップでは、以下の4つのモードのいずれかでXLEAP-SBSシーケンスランを開始します。

• クラウドモード：ランは、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの［Planned Runs］のリストから選択されます。シーケンス中にCBCLデータがBaseSpace Sequence Hubにアップロードされます。シーケンスが完了すると、BaseSpace Sequence HubでDRAGENが自動的に開始されます。
• ハイブリッドモード：ランは、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの［Planned Runs］のリストから選択されます。シーケンスが完了すると、装置上の解析が自動的に開始されます。CBCLデータとDRAGENの二次解析出力ファイルが、選択された出力フォルダーに保存されます。
• ローカルモード：v2ファイル形式のサンプルシートを手動でNextSeq 1000/2000 Control Softwareにインポートします。シーケンスが完了すると、装置上の解析が自動的に開始されます。CBCLデータとDRAGENの二次解析出力ファイルが、選択された出力フォルダーに保存されます。［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、シーケンス完了後にBaseSpace Sequence Hubアプリを介して解析を開始することもできます。
• スタンドアロンモード：ランをセットアップし、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの手順に従ってCBCLデータを生成します。

プレランチェック中またはラン中にバイザーを開くと、ランが失敗する可能性があります。

バイザーの開閉中は、怪我をしないよう装置に手を近づけないでください。

1. 「ランモードの設定」の説明に従って、ランモードを設定します。
2. ［Start］を選択します。
3. BaseSpace Sequence Hubのサインイン認証情報を入力し、［Sign In］を選択します。
4. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、BaseSpace Sequence HubのRun Planningで作成したランを含むワークグループを選択します。

間違いを避けるため、ワークグループの選択は必須です。続行する前にワークグループを選択したことを確認してください。

5. ［Next］を選択します。
6. ランを選択します。
7. ［Analysis］、［Run Length］、［Secondary Analysis］のバージョンが、正しいランと一致していることを確認します。

［Analysis］に［Cloud_］と表示され、解析がBaseSpace Sequence Hubで行われることを示します。

8. ［Review］を選択します。
9. （オプション）カスタムリードプライマーとカスタムインデックスプライマーの位置を入力します。

カスタムプライマーの調製と添加の詳細については、「カスタムプライマー」を参照してください。使用するライブラリー調製キットのCompatible Productsページを参照して、イルミナカスタムプライマーが必要かどうかを確認してください。

10. （オプション）カスタムレシピを選択します。詳細については、「ダークサイクルシーケンス」を参照してください。

Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero PlusキットまたはIllumina Stranded mRNA Prepキットを使用する場合は、カスタムレシピが自動的に選択されます。

11. （オプション）ライブラリーを手動で変性して希釈するには、［Denature and Dilute On Board］チェックボックスの選択を解除します。「手動でのXLEAP-SBSの変性および希釈」を参照してください。

デフォルト設定は、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの設定に従います。

12. （オプション）出力フォルダーを変更するには、［Output Folder］フィールドを選択して新しい場所を入力します。

［Output Folder］フィールドはデフォルト設定から自動入力されます。［Proactive, Run Monitoring and Storage］が選択されている場合を除き、出力フォルダーは必須です。

［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、［Save to BaseSpace Sequence Hub］に［Enabled］と表示されます。

［Proactive and Run Monitoring］を選択した場合は、［Save to BaseSpace Sequence Hub］に［Disabled］と表示されます。

13. ラン情報を確認し、［Prep］を選択します。
1. 「ランモードの設定」の説明に従って、ランモードを設定します。
2. ［Start］を選択します。
3. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］または［Proactive and Run Monitoring］を選択した場合は、BaseSpace Sequence Hubのサインイン認証情報を入力し、［Sign In］を選択します。
4. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、ランを保存するBaseSpace Sequence Hubのワークグループを選択し、［Next］を選択します。

間違いを避けるため、ワークグループの選択は必須です。続行する前にワークグループを選択したことを確認してください。

5. ［Start With Sample Sheet］の［Choose...］を選択し、NextSeq 1000/2000装置、ポータブルドライブ、またはマウントされたネットワークドライブにあるv2サンプルシートの場所に移動します。サンプルシートのファイル名には特殊文字を使用できません。

NextSeq 1000/2000 Control Software v1.3以降では、サンプルシートからDRAGENのバージョンが自動的に検出され、必要に応じてバージョンを切り替えるように指示されます。システムには該当するバージョンのDRAGENがインストールされている必要があります。インストールについては、「ソフトウェアのアップデート」を参照してください。

• Run Planning Used：該当する場合は、サンプルシートv2とサポートファイルが入っている.zipフォルダーを選択します。そうでない場合は、サンプルシートv2を選択します。
• Run Planning Not Used：二次解析サポートファイルがサンプルシートv2と同じディレクトリにあることを確認します。

選択したサンプルシートはv2形式でなければなりません。サンプルシートv2を作成するには、BaseSpace Sequence HubのRun Planningから生成済みのサンプルシートをダウンロードするか、NextSeq 1000/2000サポートページで提供されているサンプルシートv2テンプレートを編集します。サンプルシートv2の形式と要件の詳細については、オンライン上のSample Sheet v2のページを参照してください。サンプルシートで参照されているすべてのファイルがサンプルシートと同じフォルダーにあることを確認してください。

6. ［Review］を選択します。
7. （オプション）カスタムリードプライマーとカスタムインデックスプライマーの位置を入力します。

カスタムプライマーの調製と添加の詳細については、「カスタムプライマー」を参照してください。使用するライブラリー調製キットのCompatible Productsページを参照して、イルミナカスタムプライマーが必要かどうかを確認してください。

8. （オプション）カスタムレシピを選択します。詳細については、「ダークサイクルシーケンス」を参照してください。

Illumina Stranded Total RNA Prep with Ribo-Zero PlusキットまたはIllumina Stranded mRNA Prepキットを使用する場合は、カスタムレシピが自動的に選択されます。

9. （オプション）ライブラリーを手動で変性して希釈するには、［Denature and Dilute On Board］チェックボックスの選択を解除します。「手動でのXLEAP-SBSの変性および希釈」を参照してください。

デフォルト設定は、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの設定に従います。

10. （オプション）出力フォルダーを変更するには、［Output Folder］フィールドを選択して新しい場所を入力します。

［Output Folder］フィールドはデフォルト設定から自動入力されます。［Proactive, Run Monitoring and Storage］が選択されている場合を除き、出力フォルダーは必須です。

［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、［Save to BaseSpace Sequence Hub］に［Enabled］と表示されます。

［Proactive and Run Monitoring］を選択した場合は、［Save to BaseSpace Sequence Hub］に［Disabled］と表示されます。

11. ラン情報を確認し、［Prep］を選択します。
1. 「ランモードの設定」の説明に従って、ランモードを設定します。
2. ［Start］を選択します。
3. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］または［Proactive and Run Monitoring］を選択した場合は、BaseSpace Sequence Hubのサインイン認証情報を入力し、［Sign In］を選択します。
4. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合は、ランを保存するBaseSpace Sequence Hubのワークグループを選択し、［Next］を選択します。
5. ［Set Up New Run］を選択します。
6. ［Run Name］フィールドに、セットアップするランを識別するための固有の名前を入力します。

ラン名には、英数字、ダッシュ、ハイフン、アンダースコアを使用できます。

7. ［Read Type］で、実行するシーケンスリードの回数を選択します。
• Single Read：1リードのみを実行します。これは簡便性と速度を重視したオプションです。
• Paired End：リードを2回実行します。2回のリードを統合することで、高品質なデータが得られ、アライメントの精度が向上します。
8. 各リードで実行するサイクル数を入力します。

インデックスサイクル数に上限はありませんが、リードサイクルとインデックスサイクルの合計数を、カートリッジラベルに記載されているサイクル数に38を足した数より小さくする必要があります。「サポートされるサイクル数」を参照してください。

• Read 1：26～301のサイクル数を入力します。
• Index 1：インデックス1（i7）プライマーのサイクル数を入力します。PhiXのみのランの場合は、両方のインデックスフィールドに「0」と入力します。
• Index 2：インデックス2（i5）プライマーのサイクル数を入力します。
• Read 2：301サイクルまでの値を入力します。この値は通常、［Read 1］の値と同じです。
9. ［Proactive, Run Monitoring and Storage］を選択した場合、［Choose...］を選択してサンプルシートをインポートします。

NextSeq 1000/2000 Control Software v1.3以降では、サンプルシートからDRAGENのバージョンが自動的に検出され、必要に応じてバージョンを切り替えるように指示されます。システムには該当するバージョンのDRAGENがインストールされている必要があります。インストールについては、「ソフトウェアのアップデート」を参照してください。

選択したサンプルシートはv2形式でなければなりません。サンプルシートv2を作成するには、BaseSpace Sequence HubのRun Planningから生成済みのサンプルシートをダウンロードするか、NextSeq 1000/2000サポートページで提供されているサンプルシートv2テンプレートを編集します。サンプルシートv2の形式と要件の詳細については、オンライン上のSample Sheet v2のページを参照してください。サンプルシートで参照されているすべてのファイルがサンプルシートと同じフォルダーにあることを確認してください。

10. （オプション）カスタムリードプライマーとカスタムインデックスプライマーの位置を入力します。

カスタムプライマーの調製と添加の詳細については、「カスタムプライマー」を参照してください。使用するライブラリー調製キットのCompatible Productsページを参照して、イルミナカスタムプライマーが必要かどうかを確認してください。

11. （オプション）カスタムレシピを選択します。詳細については、「ダークサイクルシーケンス」を参照してください。
12. （オプション）ライブラリーを手動で変性して希釈するには、［Denature and Dilute On Board］チェックボックスの選択を解除します。「手動でのスタンダードSBSの変性および希釈」を参照してください。

デフォルト設定は、NextSeq 1000/2000 Control Softwareの設定に従います。

13. （オプション）出力フォルダーを変更するには、［Output Folder］フィールドを選択して新しい場所を入力します。

［Output Folder］フィールドはデフォルト設定から自動入力されます。［Proactive, Run Monitoring and Storage］が選択されている場合を除き、出力フォルダーは必須です。

14. ［Prep］を選択します。
1. （グレーのツマミを取り外した）フローセルと希釈済みライブラリーをロードする前に、カートリッジがすでに融解していて、「カートリッジの準備」に従って準備されていることを確認します。
2. ［Load］を選択します。

バイザーが開いてトレイが排出されます。

3. カートリッジをトレイに載せます。その際、ラベルを上に向け、フローセルが装置の中に入るようにします。カートリッジを押し込んで固定します。

4. ［Close］を選択します。カートリッジが格納されてバイザーが閉まります。

約3分後、スキャンされた消耗品の情報が表示されます。

5. （オプション）［Eject Cartridge］を選択し、カートリッジを取り出します。

1分後にバイザーが開き、カートリッジが排出されます。

6. ［Sequence］を選択します。

プレランチェックでは、装置チェックの後にフルイディクスチェックが行われます。フルイディクスチェック中にカートリッジのシールに穴が開けられます。このとき、ポンという音が3～4回装置から聞こえますが、この音は正常です。これで試薬がフローセルを通過できるようになります。

フルイディクスチェックが開始された後、消耗品は再利用できません。

1. プレランチェックが完了するまで15分ほど待ちます。

正常に完了すると、ランが自動的に開始します。

2. 装置チェック中にエラーが発生した場合は、［Retry］を選択してチェックをやり直します。

チェックが進行している間、現在のチェック項目を示す円が表示されます。

3. 繰り返し発生するエラーのトラブルシューティングを行うには、「エラーメッセージの解消」を参照してください。
1. ［Sequencing］画面に表示されるランの進捗状況とメトリクスをモニタリングします。
• Estimated run completion：ランが完了する予想日時。Estimated run completionメトリクスでランの完了日時を正確に計算するには、既にランを10回実行している必要があります。
• Average %Q30：Qスコアが30以上であるベースコールの平均比率。
• Projected Yield：そのランでコールされる塩基の予想数。
• Total Reads PF：フィルターを通過したペアエンド（該当する場合）クラスターの数（百万単位）。
• Real Time Demux：Read 1、Index 1、Index 2のサイクルが完了した後、Read 2の開始時に行われるデマルチプレックスのステータス。インデックスサイクルが実行されていない場合でも、ステータスは［Complete］と表示されます。クラウドモードのランでは使用できません。
• Real Time Alignment：Read 1、Index 1、Index 2のサイクルが完了した後、Read2の開始時に行われるRead 1のアライメントのステータス。クラウドモードのランでは使用できません。

Q30とYieldのメトリクスは、26サイクル以降に表示されます。

2. ランのプロセスをモニタリングするには、コントロールソフトウェアのメニューから［Process Management］を選択します。
3. ランを取り消すには、［End Run］を選択します。ランの取り消しの詳細については、「ランの取り消し」を参照してください。
4. 装置から消耗品を取り出します。カートリッジは3日以内に装置から取り出してください。